Szövetépítés egész szíven

Világszerte évente több ezer kiterjedt szívinfarktuson átesett betegnél alakul ki súlyos szívelégtelenség. A progresszív betegség kezelése és megelőzése a ma ismert legmodernebb technikák alkalmazása ellenére sem megoldott (1). A kialakult krónikus megbetegedés hatalmas terhet ró mind a betegekre és családjaikra, mind a társadalomra. A végstádiumú szívelégtelenség egyetlen igazi megoldása a szívátültetés, ez azonban a csökkenő donorszám miatt nem tudja kielégíteni az igényeket.
Az emberi szív regenerációs képessége korlátozott, hiszen az érett szívizomsejtek nem képesek osztódni, ezért a szívizmot ért károsodások jobbára visszafordíthatatlanok. A mesterségesen előállított szívizomszövet alternatívát kínálhat a károsodott szívizom pótlására.
A kialakult balkamra-funkció elégtelensége esetében terápiás lehetőség az LVAD (left ventricular assist device, bal kamrai keringéstámogató eszköz) beültetése, ez azonban általában nem jelent végleges megoldást, hanem csupán áthidaló kezelést a transzplantációig (9): 859–867.">(2). Mind­ezek ismeretében felmerül az igény egy olyan terápiás lehetőség iránt, amely képes visszafordítani ezt a gyakori, progresszív kórképet. Egy ígéretes megoldás lehet a jövőben a szívstruktúrákra fókuszáló szövetépítés.
A myocardium súlyosan károsodott vagy már elhalt sejtjeinek helyettesítése mind az orvosoknak, mind a betegeknek egy új terápiás lehetőséget jelent; ez képezi az egész szíves szövetépítés mozgatórugóját. Az elégtelen szervműködés kialakulásától kezdve adott a lehetőség, hogy egy részleges vagy egész szerv integrálható legyen a súlyosan heges myocardiumhoz vagy transzplantáció során teljesen átvehesse a szívműködést (3).

A szövetépítés klasszikus paradigmái

Számos kísérlet történt szövetalapú szívizomgraftok létrehozására, azonban minden modell esetében érvényes két alapvető feltétel. Egyrészt, szükség van egy háromdimenziós támasztószövetre vagy vázra, amely kielégíti az alábbi kritériumokat:

1. megfelelő mechanikai és biológiai integritása van,
2. dinamikus és biokémiai jelátvitelre képes,
3. sejtkapcsolatok és migráció alakulhat ki benne,
4. biztosítja a létfontosságú tápanyagok és faktorok diffúzióját, valamint
5. teret biztosít a vázszerkezet dinamikus változásainak.

Az ilyen vázakat eredetük alapján két csoportba oszthatjuk: szintetikus és biológiai vázak (4). Másrészt szük­ség van egy celluláris komponensre, amelynek elő­állítására két módszer lehetséges: vagy autológ ere­detûek és in vitro úton nyerhetők ki, vagy dinamikus, kémiailag stimulált környezetből állíthatók elő. Az előállítás lényege, hogy a létrehozott bioanyag képes legyen molekuláris szinten, pontos és szabályozott mó­don kommunikálni a sejtekkel, hasonlóképpen a sejtek és az extracelluláris mátrix (ECM) között található fiziológiás interakciókhoz.
Következésképpen az elmúlt években a kutatások olyan bioaktív anyagok kifejlesztésére irányultak, amelyek rendelkeznek egyrészről a szintetikus polimerek szilárdságával és degradációs kinetikájával, másrészről az extracelluláris mátrix összetevőinek – kollagén, fibronektin, laminin – biológiai specificitásával.
Az épített szöveti struktúrával szemben követelmény, hogy

• kontraktilis,
• elektrofiziológiailag stabil,
• mechanikailag szilárd ugyanakkor flexibilis,
• vaszkularizált vagy gyors vaszkularizálódási potenciállal bíró legyen. Emellett
• ne legyen immunogén (9): 1639–1647.">(5).

Ilyen ideális szerkezet ma még nem létezik. A közelmúlt kutatásai azonban már létrehoztak olyan szerkezeteket, amelyek kielégítik ezeknek az ambiciózus kritériumoknak egy részét.

A decellularizációs kezelés rövid összefoglalása

Számos decellularizációs protokoll került kifejlesztésre, amelyek lényegesen eltérnek egymástól a kezelés során kapott acellularitás mértéke, az előállított ECM-váz antigenitása, valamint a folyamat által okozott, extra­celluláris mátrixot ért károsodás tekintetében (6, 7, 8). A legtöbb szövettípus teljes decellularizációjához az adott szövettípusra specializált fizikai, enzimatikus és kémiai kezelés szükséges. Általánosságban elmondható, hogy az acelluláris mátrix kinyeréséhez elégséges legenyhébb protokollt kell alkalmazni, amellyel így elkerülhető az extracelluláris mátrix funkcionális és strukturális komponenseinek sérülése.
A leggyakrabban alkalmazott decellularizációs ágenseket 4 csoportba oszthatjuk:

• nem-ionos detergensek (pl. Triton X 100) (9, 10, 11),
• ionos detergensek (pl. SDS) (9, 10, 12, 13), dezo­xi­kolsav/DOA (12, 14, 15, 16),
• enzimek (pl. tripszin) (10, 17, 18), RNázok, Dnázok (19, 20),
• keláló anyagok (pl. EDTA) (21, 22).

A legtöbb esetben a fent említett decellularizációs kezelések és kombinációik kerülnek alkalmazásra. Az SDS (12, 14), valamint az ionos és nem-ionos deter­genseket kombináló protokollok (14) kiváló decellu­la­rizáló képességet mutattak, ugyanakkor megőrizték az extra­cel­lu­láris mátrix molekuláris szerkezetét. Kimu­tatták továbbá, hogy az SDS-kezelés a kollagénrostok szétválását (14), valamint a kollagén fragmentációját és duzzadását (23) váltotta ki. Egyéb faktorok is befolyásolhatják az extracelluláris mátrix megtartásának mértékét:

• a detergens koncentrációja,
• a kezelés időtartama,
• különböző proteáz-inhibitorok jelenléte, valamint
• a fajok közötti különbségek (11).

Kutatócsoportunk kifejlesztett egy perfúzión alapuló technikát, amely a gyakran használt detergens, az SDS alkalmazására épül (24). Vizsgálataink során az általunk SDS-sel létrehozott biológiai mátrix nem tartalmazott látható sejtes elemeket (1. ábra).
Egyértelmű, hogy a fizikai, enzimatikus és kémiai kezelések jelentős hatással bírhatnak a természetes szövetek és szervek decellularizációjával létrehozott biológiai vázak összetételére és mechanikai tulajdonságaira, valamint a host által tanúsított válaszreakcióra, amelynek következtében szerepük nem elhanyagolható az ezt követő in vitro és in vivo alkalmazások során.
Az adhéziós fehérjék és glükózamino-glikánok eltávolítása a biológiai vázból lelassíthatja a sejtek vázra való migrációját, valamint magának a váznak a bioaktivitását.
A kollagénhálózat megbomlása megváltoztatja a váz mechanikai viselkedését és a kollagénrostok kinetikáját, ezáltal befolyásolja a váz terheléstûrő kapacitását, illetve megváltoztatja a sejtek mechanikai környezetét is. Emellett a kollagén lebomlása is jelentősen befolyásolja a váz bioaktivitását és mechanikai jellemzőit. Az alkalmazott kémiai kezelések tovább gyengíthetik az ECM-vázat úgy, hogy csökkentik az in vivo enzi­ma­tikus bontással szembeni ellenálló képességét, így felgyorsítják a váz tartóerejének csökkenését.
Valószínűtlen, hogy létezik olyan módszer, amely száz százalékban eltávolítja az adott szövet vagy szerv sejtes összetevőit. Úgy tűnik azonban, hogy azok a technikák, amelyek a látható sejtes elemek nagy részét vagy összességét eltávolítják, biztonsággal beültethető biológiai vázat hoznak létre (25).

1. ábra Perfúziós technikával decellularizált disznószív makroszkópos képe A) Az SDS-decellularizáció után 12 órával B) Decellularizált bal kamra megtartott kamrák közötti elrendeződéssel (szívbillentyűhúrokkal együtt)

Bioartificiális szív a kardiális szövetépítés jövője?

Egészen a közelmúltig az „egész szív” mesterséges létrehozása kivitelezhetetlen feladat volt. Sőt, bármely működő, komplex, vaszkularizált, háromdimenziós szö­vet vagy szerv létrehozását megoldhatatlan feladatnak tekintették a szövetépítés terén, ugyanis a szervek ultrastruktúrájának in vitro reprodukálása – illetve még csupán a minimális komplexitással rendelkező szövetek fenntartásához szükséges elegendő bonyolultságú ér­há­lózat létrehozása – túlságosan nehéz feladatnak bizonyult. Egy teljes mértékben szintetikus szív létrehozása speciális kihívást jelent, lévén a myocardium egy kont­raktilis szövet, különleges strukturális és energetikai jellemzőkkel. Ilyen például a szívizom és a billentyűk kapcsolata, amely biztosítja a vér ki- és beáramlását a szív üregeiből – ehhez azonban elengedhetetlen a speciális térbeli elhelyezkedés, illetve a sejtek és a mátrix kö­zötti elektromos és mechanikus kapcsolat. Szintén nem elhanyagolható a szívizomszövet hypoxia iránti fokozott érzékenysége, amelynek következtében a szív­izomsejtek sűrű érhálózatot igényelnek a túléléshez és a megfelelő kontraktilis aktivitáshoz. Végül, a szívizomszövet tartalmaz őssejteket és progenitor sejteket is, amelyek képesek érett szívizomsejtek kialakítására (pl. pitvarok, kamrák vagy nodális szövet), így a szívizomszövet teljes értékű pótlására különösen nehéz alkalmas alapanyagot találni.
Ez utóbbi funkciót támasztja alá az a vizsgálat, amelyben decellularizált vázba neonatális szív eredetű sejteket injektáltak, majd folyamatos elektromos ingerlés és mechanikus töltés alatt egy bioreaktorban növesztették. A kísérlet során, 8-10 nap múlva a recellularizált bal kamrai szegmentumok kontrakcióit lehetett re­gisztrálni, illetve gyógyszerkészítményekkel válaszreakciót lehetett kiváltani (9). Egy szövetépítéssel létrehozott szív a jövőben akár használható lehet gyógyszerként alkalmazni kívánt hatóanyagok kardio­toxici­tá­sának tesztelésére is (26).
Kutatócsoportunk korábbi publikációjában szerepelnek klinikai megfigyelések az in vivo szövetépítéssel decellularizált xenograft mátrixokon létrehozott pul­mo­nalis billentyűkről (27). Jelenlegi célunk egy olyan, sorozatgyártásra alkalmas háromdimenziós miokar­diális váz létrehozása, amelyet az implantációt megelőzően lehetséges bevonni élő sejtekkel. A természet már eleve létrehozott egy teljes, vaszkularizált vázat, amely a szív szerkezeti alapját képezi, így kutatásunk kiindulópontjának ezt a már meglévő vázat választottuk. Feltételeztük, hogy a celluláris komponensek myo­car­diumból történő eltávolításával egy olyan háromdimenziós, natív szív eredetű ECM-ből álló vá­zat kapunk, amely rendelkezik az eredeti négyüregű elrendezéssel és a natív szív felépítésével. Az 1. áb­ra mutatja négyüregű decellularizált szívet: az acellu­láris mátrix megtartotta a szív finom szerkezetét és makroszkópos geometriáját. A preparálás során disznószíven, deter­gens alapú perfúziós decellu­lari­záiós technikát alkalmazva a celluláris komponensek teljes mértékben eltávolíthatóak voltak, míg a váz megőrizte a natív szív strukturális és biokémiai jellemzőit (1. ábra). Amint az 1. ábrán is látható, a szívizom falszerkezete, a billentyűk, a pa­pilláris izmok és a tra­bekulák mind megfigyelhetők a sejtek eltávolítása után is. Nem volt kimutatható adhézió, szerkezetromlás és a vitorlák megvastagodása sem. A billentyűk a további vizsgálatok során sima, egyenletes felszínt mutattak, fényáteresztő, decellularizált vi­tor­lákkal, amelyeken fe­neszt­ráció vagy duzzanat nem volt tapasztalható (3. ábra).
Az általunk végzett kísérletek során felhasznált disznószívek vágóhídi állatokból származtak; az előkészítés során a szíveket perfúziós technikával decellula­rizál­tuk, így csökkentettük a graftok antigenitását. A ké­sőbbiekben a disznószív, mint a biológiai váz potenciális forrása, számos előnnyel rendelkezhet:

3. ábra Átlátszó decellularizált aortabillentyű disz­nószívből, a vitorlák morfológiája intakt A) Az extracelluláris mátrix kollagénje megtartott B) A transzmissziós elektronmikroszkóppal ké­szült képen megfigyelhető a decellularizált aortabillentyű ultrastruktúrája, a kollagén érintetlen, magvas struktúrák nem láthatók. Vonalmérték: 1 µm

• könnyen és nagy mennyiségben beszerezhető,
• megfelelő méretű humán transzplantációra,
• a humán és disznószívek anatómiailag jelentős ha­sonlóságot mutatnak,
• a disznószövet felszíne erős celluláris adhéziós po­tenciállal bír (28), és
• rendelkezik – a szintetikus polimerekkel ellentétben – egy vaszkularizált, bazális membránnal bíró, há­rom­dimenziós, ECM-proteineket (pl. kollagént, elasztint, proteoglikánokat) tartalmazó tartómátrixszal, amely lehetővé teszi az élő sejtek migrációját.

Összességükben ezek az ECM-fehérjék kritikus elemei a szövetépítéssel létrehozott szerkezeti vázaknak mind a strukturális integritás, mind a biomechanikai tulajdonságok megtartásának szempontjából (29).
A bemutatott eredmények jól demonstrálják az egész szíves szövetépítés területén az elmúlt évek során lezajlott fejlődést. Az acelluláris állapot eléréséhez minimálisan szükséges SDS-koncentrációt alkalmazva az extra­celluláris mátrix kimutathatóan megtartja fiziológiás morfológiáját, amely így képes a beültetett sejtek differenciálódásához és működéséhez szükséges biokémiai szignálok biztosítására (30, 31).
Ezek az eredmények együttesen alátámasztják a perfúziós módszerrel decellularizált egész disznószívek, mint potenciális vázak lehetőségét a miokardiális szövetépítés terén.
Korábban számos próbálkozás történt egyszerűbb szívszövetek, mint például acelluláris vagy egyszerűbb sejtalapú szövetelemek szövetépítéssel történő megalkotására. Azonban a szívizomsejtek magas oxigenizációs és energetikai igényeinek következtében már néhány száz mikronnyi vastagságú szövet is túl vastagnak bizonyult a túlélésre (32, 33). Ezt elkerülendő, egyesek csatornázott szintetikus ECM-et kombináltak oxigénhordozókkal, mások egy sejtrétegből álló szívizomszövet-lemezeket helyeztek egymásra (34–36). Ezek a próbálkozások megerősítették azt a feltételezést, hogy a perfúzió mértéke közvetlen összefüggésben áll a graft vastagságával és a sejtsűrűséggel (33, 37). Mindezek csupán apró előrelépések a végső cél, a humán szívben találhatóhoz hasonló falvastagságú szívizomgraft létrehozásához, amely nem jöhet létre a szövettel egyidejűleg létrehozott érhálózat hiányában. Több kísérlet történt a szövetépítéssel előállított szívizomszövetekben egy érhálózat ki­építésére is (endothelsejteknek a szívizomsejteket tartalmazó lemezek közé történő rétegezése, angiogenezist serkentő növekedései faktorok alkalmazása, speciális mikropórusok létrehozása) (38), ezek közül azonban egy se jelentett definitív megoldást. A szív eredetű ECM tartalmazza a szív működéséhez elengedhetetlenül szükséges perfúziót biztosító komplex érhálózatot, ezért kutatócsoportunk kifejlesztette azt a perfúziós technikát, amelynek segítségével eltávolíthatóak a cadaver szövetből a sejtes elemek, azonban az ECM-be ágyazva megőrizhető az acelluláris vaszkuláris hálózat (2. ábra), amire a későbbiekben funkcióképes neonatális cardiomyocyták ültethetők. Ha ezek alapján a szív ECM teljes vastagságában sikerül újjáteremteni az érhálózatot, azzal megalapozható a komplex szív-struktúrák megszerkesztésének lehetősége.

2. ábra A Masson-féle trikróm (MA) festéssel ke­zelt natív és decellularizált kamrai szövet fénymikroszkópos képe jól mutatja, hogy a decellu­la­rizáció során az extracelluláris mátrix kollagén és elasztikus rostjai nem károsodtak. A) Natív kamra (MA) B) Decellularizált kamra (MA) Vonalmérték: 200 µm Masson-féle trikróm festés: citoplazma – vörös, erit­rocita – vörös, izom – vörös, kollagén – kék, sejt­mag – sötétbarna

Következtetések

Bár az egész szíves szövetépítés tudománya még a kezdeteknél tart, a bioarteficiális úton létrehozott szervek számos problémára kínálhatnak megoldást – többek között a fejlődésbiológia, a kórélettan és a sejtterápia kutatási területein. Összefoglalónkban bemutattuk, hogy a perfúziós technika a natív szívizomban található transzportviszonyokhoz hasonló feltételeket teremt, így lehetővé teszi egységes szöveti szerkezetű, háromdimenziós acelluláris szerkezetek in vitro létrehozását.
Az disznószívek SDS-perfúziós decellularizációjával olyan váz nyerhető, amely a további kutatások során az egész szíves szövetépítés alapját képezheti. Az általunk elért eredmények megteremtik egy olyan szívizomszövet felépítésének lehetőségét, amely egyaránt rendelkezik kontraktilis képességgel, képes reagálni gyógyszerekre, továbbá képes az utóterheléssel szembeni fo­lya­déktovábbításra.
Az általunk kifejlesztett perfúziós decellularizációs technika segítségével olyan háromdimenziós xenograft vázat tudunk létrehozni, amely egyben acelluláris és recellularizálható (10). Az SDS-sel végzett sejteltávolítás technikailag egyszerű, mégis csaknem totális acel­lularitást eredményez, ugyanakkor nem befolyásolja jelentősen az extracelluláris mátrix morfológiáját. Ku­ta­tómunkánk további célja kideríteni, hogy – amint ezt már kisebb modelleken kimutatták (9) – ezek a háromdimenziós vázak alkalmasak lehetnek-e erőkifejtésre és ingervezetésre képes élő, kontraktilis sejteket tartalmazó, intakt szívizomszövet fenntartására.

Támogatás

Jelen munka a Land Baden-Württenberg és a TÁMOP 4.2.2-08/1/KMR-2008-0004 támogatásával készült.